背景と目的 胆嚢癌は高度に侵襲的な消化器系悪性腫瘍であり、患者の5年生存率は10％未満です。既存の二次元(two-dimensional、2D)細胞培養モデルは、腫瘍の三次元(three-dimensional、3D)組織学的特徴および薬剤応答を正確に反映するのが困難であり、薬剤スクリーニングや機序研究に制限があります。3Dバイオプリンティング技術は、制御可能な方法で複雑な構造の腫瘍モデルを構築し、体内微小環境を模擬することが可能です。本研究では、メタクリロイル化ゼラチン(gelatin methacryloyl、GelMA)を用いて3Dバイオプリンティング胆嚢癌モデルを構築し、その分子特性および薬物感受性における2Dモデルとの違いを比較することを目的としました。方法 本研究では、NOZヒト胆嚢癌細胞株およびGelMAハイドロゲルバイオインクを用いて3D胆嚢癌モデルを構築し、押出式バイオプリンティング技術により腫瘍微小環境のシミュレーションを実施しました。3Dモデルの細胞形態および増殖活性は顕微鏡、生細胞/死細胞染色、細胞計数キット-8(cell counting kit-8、CCK-8)にて評価しました。RNA抽出後、Illumina NovaSeq™ 6000プラットフォームでRNAシーケンスを行い、DESeq2による差次的発現解析を実施し、リアルタイム蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction、RTFQ-PCR)により一部の差次的発現遺伝子を検証しました。薬物感受性検査は、ゲムシタビン(gemcitabine、GEM)、シスプラチン(cisplatin、DDP)、アルブミン結合型パクリタキセル(nab-paclitaxel)および5-フルオロウラシル(5-fluorouracil、5-FU)を用いた用量反応実験により行い、半数阻害濃度(half-maximal inhibitory concentration、IC50)を算出してモデルの各薬物に対する感受性を評価しました。統計解析はGraphPad Prism 9.0およびR 4.4.0ソフトウェアを用い、P<0.05を統計学的有意差としました。結果 3Dモデルは構造的に安定し、細胞はハイドロゲル内で高い活性を維持し球状の集合体を形成し、その増殖能力は2Dモデルより有意に高かったです。トランスクリプトームシーケンスにより、617個の差次的発現遺伝子が同定され、そのうち235個が上方制御され382個が下方制御されており、主に細胞周期、炎症反応およびサイトカインシグナル伝達経路に富集していました。RTFQ-PCRの検証結果はRNAシーケンス結果と一致しました。薬物感受性検査の結果、3Dモデルは複数の化学療法薬に対するIC50が2Dモデルより高く、臨床腫瘍の耐性特性により近いことを示しました。結論 本研究は3Dバイオプリンティング胆嚢癌モデルを構築しました。2D培養と比較して、3DモデルはGEM、DDP、nab-paclitaxelおよび5-FUに対する感受性が低くIC50が高く、臨床固形腫瘍の耐性特性とより適合しています。したがって、3Dモデルは臨床の薬剤耐性および低感受性の模倣において2Dより優れており、耐性機序研究および候補薬物・併用療法のスクリーニング検証に活用可能です。

胆嚢癌;三次元バイオプリンティング;GelMAハイドロゲル;トランスクリプトミクス;薬物感受性;インビトロモデル