肿瘤类器官研究现状与展望 中国癌症杂志    2024, 34 (8): 763-776.   DOI: 10.19401/j.cnki.1007-3639.2024.08.006

图3 类器官培养流程和新技术

正文中引用本图/表的段落

肿瘤类器官的传统培养方法是将分离消化的肿瘤样品与基质胶混合，滴加到培养皿中央形成“水滴状”结构，待基质凝固后加入含有特殊因子[如R-spondin1、Wnt3a、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等]的培养基进行3D培养[35]（图3A）。然而，这种培养模式下类器官生长缓慢、培养成功率低，通常7~21 d后才可进行传代，研究效率较为低下[36]。结合微流控技术开发OoC是提高类器官培养速度和通量的重要途径，微流控（microfluidics）技术是可以精确操控微尺度流体的技术，能够将物理、化学、生物和医学研究中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到单一微米级芯片上，实现分析与操控过程的自动化[37]。OoC则是将微流控技术应用于类器官培养的创新成果，是一种集成化的细胞培养设备，能准确地纳入在体器官的关键微环境参数，有助于真实模拟体内环境，提高类器官培养的速度和通量，代表了器官级的“合成生物学”[38]。在OoC的内部结构中，信号发生器负责控制信号梯度的调节和细胞反应，多孔膜分隔的区室和围栏模拟组织间的分隔和相互作用，而微柱阵列则有助于营养成分的扩散和代谢物的清除，这样的结构可以有效地模拟肿瘤在体内的生长模式，为类器官生长提供适合的仿生环境（图3B）[39?-41]。因此，相比于传统培养方法，使用OoC培养的肿瘤类器官在分子生物学特征和药物敏感性结果方面更接近于肿瘤在体内的真实情况。有研究使用这两种方法分别培养三阴性乳腺癌类器官，发现使用OoC培养的三阴性乳腺癌类器官在营养获取和代谢物清除方面更加充分和便捷，从而增强了对多柔比星等化疗药物的抵抗性，更接近于临床用药的实际情况[42]。

既往类器官模型在分离和培养过程中往往特异性富集上皮性肿瘤细胞，而无法保留基质与免疫成分，导致其在模拟肿瘤微环境方面的能力受到很大限制，而肿瘤微环境作为“土壤”在肿瘤发生、发展中起着关键作用，因此研究人员致力于在类器官模型基础上构建更为复杂的肿瘤微生态系统，以更好地模拟肿瘤微环境[39-40]。其中一种构建方法是“重组法”，是指将不同类型的细胞直接共培养，复刻肿瘤细胞与其他细胞间的相互作用。目前“重组法”的主要研究方向是优化共培养条件，有研究通过构建更接近真实肺泡呼吸膜的共培养环境，改进成纤维细胞和肺癌细胞的共培养模式，发现该体系能够有效地模拟成纤维细胞诱导的肺癌细胞表型改变及其侵袭迁移能力的提升，为研究肿瘤细胞与成纤维细胞互作提供了很好的研究模型[43]。但是不同患者间肿瘤微环境存在高度异质性，“重组法”并不能准确地复现肿瘤微环境特征，另一种构建肿瘤微生态的方法“整体法”则一定程度上解决了“重组法”存在的上述问题。“整体法”是指解离组织后将获得的细胞悬液（包含肿瘤细胞和其他微环境细胞）混合在一起接种入基质胶进行共培养，目前主要的研究方向是通过优化OoC技术，增强类器官培养体系对肿瘤微环境细胞的支持，更好地模拟体内环境，例如，利用OoC精准地控制氧气供应和趋化因子的浓度梯度，维持微环境细胞的活力和表型[44]；在OoC表面覆盖基质胶，增强类器官黏附力并模拟细胞外基质的功能[45]；定制细胞的空间取向和类型组成，模拟肿瘤发生发展过程中不同类型肿瘤细胞与免疫细胞间的真实作用过程（图3C）。

目前，类器官模型在血管化技术方面还不够成熟，当类器官球体直径生长到约150 μm时，由于缺乏血管网络的支持，类器官中会出现缺氧和代谢物堆积，导致细胞增殖停滞和核心区域的坏死，体积无法进一步增大[46]。随着类器官研究的深入，血管化技术也不断取得突破，主要采用三种方式促进类器官中血管的形成：① 在现有干细胞诱导分化策略中增加促进血管生成的诱导因子，引起血管样网络的构建。Cakir等[47]通过在人类胚胎干细胞中异位表达ETV2基因，在人类皮质类器官中成功地构建了血管样网络，不仅增强了类器官的功能成熟度，而且模拟了血脑屏障的特性。② 类器官与血管内皮细胞共培养也是一种有效的血管化策略。Shirure等[48]通过将乳腺癌类器官与血管内皮细胞及免疫细胞共培养，发现类器官模型中形成了类似血管的结构，并对抗血管生成治疗敏感。③ 工程化技术如3D打印、微流控和静电纺丝等，也被用于在体外构建血管样结构，实现类器官的血管化[49]。Rajasekar等[50]利用定制的微流控平台，成功构建了血管化的结肠类器官，并发现原代内皮细胞和成纤维细胞可在3天内自发形成可灌注的血管床（图3D）。

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